在弱碱性条件下，氨基酸的α-氨基可与苯异硫氰酸酯（phenylisothiocyanate, PITC）反应，生成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在酸性条件下，PTC-氨基酸会迅速环化，形成稳定的苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。
多肽链N-端氨基酸的α-氨基如果没有被封闭，例如甲酰化修饰，那么也能发生此反应，生成PTC-肽。在酸性溶液中，PTC-肽会释放出末端的PTH-氨基酸，而产生比原来少1个氨基酸残基的肽链。新暴露出来的N-端氨基可再次进行同样的反应。经过多次重复，N-端的氨基酸依次释放出来，成为PTH-氨基酸。
由于PTH-氨基酸在酸性条件下极稳定，并可溶于乙酸乙酯，因此在每一次反应结束以后用乙酸乙酯抽提，再经高压液相层析，就可以确定肽链N-端氨基酸的种类，并逐步确定出一个完整的多肽链上的氨基酸顺序。氨基酸自动顺序分析仪就是根据该反应原理而设计的。
